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最好選擇兩個不同種源的抗體。選擇同一種源的抗體的問題在于：在WB之前進行的蛋白變性這一步，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇，巰基乙醇會把抗體的重鏈和輕鏈之間的二硫鍵破壞，從而使的抗體變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD。假設你IP的抗體是兔抗的，目的蛋白進行WB的抗體也是兔抗的，而且目的蛋白的分子量為55KD，可以想象，55KD的位置除了你的目的蛋白以外，還有IP抗體的重鏈IgG。由于IP的抗體用量非常大（1ug），就導致55KD處的信號會非常強。如果你用抗兔的二抗進行顯色，那么55KD處的ip抗體的重鏈和你的目的蛋白會重疊在一起，無法分辨。
然而這個時候如果你的目的蛋白進行WB的抗體不是兔抗的，比如小鼠抗的，那么就需要用抗小鼠的二抗進行顯色，而抗小鼠的二抗是無法跟兔抗的IP抗體發(fā)生反應的。因此55KD位置的IP抗體的重鏈IgG就無法顯色，發(fā)生反應的就是你的目的蛋白了。