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ReadyPour 8% Bis Tris  Solution是一種Acrylamide膠預(yù)混液，該預(yù)混液安全、快速、操作簡(jiǎn)單、解析度高

本品已預(yù)先配制成 8% 分離膠液體，按照百分之一的比例加入相應(yīng)量的 10%過硫酸銨或其替代物溶液

按照千分之一的比例加入相應(yīng)量的 TEMED。

例如 10ml 12% SDS-PAGE 分離膠預(yù)混液中，加入 100μl 10%過硫酸銨和 10μl TEMED

即可直接灌膠，能在10分鐘以內(nèi)完成凝膠（夏季3-5分鐘）

凝膠時(shí)間快，無須再自行配置並節(jié)省時(shí)間

 

 

注意：

1.APS和TEMED品質(zhì)的好壞會(huì)影響凝膠時(shí)間，請(qǐng)用新鮮配制的APS;

2.由于凝膠速度快,請(qǐng)勿比照傳統(tǒng)制膠方式采用槍頭轉(zhuǎn)移進(jìn)行灌膠;

3.灌入分離膠后記得取起制膠架輕輕拍敲桌面以利膠體鍵結(jié)緊實(shí);

4.分離膠與濃縮膠之間無須用水壓平,因此灌上層濃縮膠時(shí)不要在固定位點(diǎn)擠壓灌膠;

5.抽拔齒梳時(shí), 齒梳左右二邊一定要平,輕緩慢慢拔起;

 

操作方式:

1.在擠壓瓶中加入相應(yīng)比例TEMED和APS后即可進(jìn)行灌膠

  (等同傳統(tǒng)計(jì)算方式:TEMED為配膠總體積的千分之一,APS為配膠總體積的百分之一)

2.取分離膠擠壓瓶在玻璃板中空縫隙中選擇一位點(diǎn)擠壓灌入制作分離膠,

3.然后將整座制膠架取起,輕輕拍敲桌面兩下即可

 

分離膠擠壓瓶中的剩余預(yù)混液凝結(jié)成果凍狀后,即代表已凝膠 

用于制備SDS Page凝膠或WB實(shí)驗(yàn)?zāi)z

 

學(xué)習(xí)Western Blot技術(shù)，首先要學(xué)習(xí)的就是手灌膠技術(shù)。

手灌膠技術(shù)是WB實(shí)驗(yàn)中最基本的技術(shù)，雖然現(xiàn)在預(yù)制膠橫行天下

但是對(duì)于某些特定蛋白或比較極端分子量的蛋白，

預(yù)制膠達(dá)不到好的分離效果

有些表達(dá)量極低的蛋白預(yù)制膠膠孔達(dá)不到足夠上樣量

我們就需要根據(jù)待分離蛋白的特性來配制聚丙烯酰胺凝膠

 

傳統(tǒng)制膠及步驟繁瑣之處:

（1）手灌膠各成分介紹；

 

a.丙烯酰胺：形成聚丙烯酰胺的基本物質(zhì)，具有神經(jīng)毒性及致癌性（WB所用試劑幾乎都具有強(qiáng)毒性，做好實(shí)驗(yàn)的前提，先要保護(hù)好自己）；

b.Tris-Hcl:在蛋白電泳中與Gly構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過程中的PH穩(wěn)定，Tris（氨丁三醇）可致癌；

c.過硫酸銨（AP）：相當(dāng)于催化劑作用，提供兩種丙烯酰胺聚合所必須的自由基；

d.TEMED（四甲基二乙胺）:催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)，促進(jìn)聚丙烯酰胺凝膠形成（凝固劑）,具有強(qiáng)烈刺激性氣味（惡臭），并具強(qiáng)神經(jīng)毒性；

e.SDS（十二烷基硫酸鈉）：能使蛋白變性，具有呼吸刺激性。

（2）常用分離膠濃度與最佳分離范圍；

分離膠濃度	最佳分離范圍（kD）
6%	50—150/60-220
8%	30—90
10%	20—80
12%	12—60
15%	10–40

備注：分離膠濃度越大，最佳分離蛋白分子量越小。

（3）分離膠配制(兩塊膠量—10ml)；

成分	分離膠濃度
	6%	8%	10%	12%	15%
超純水	5.3ml	4.6ml	4ml	3.3ml	2.3ml
30%丙烯酰胺	2ml	2.7ml	3.3ml	4ml	5ml
1.5M Tris（PH8.8）	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml
10%SDS	100μl	100μl	100μl	100μl	100μl
10%AP	100μl	100μl	100μl	100μl	100μl
TEMED	4μl	4μl	4μl	4μl	4μl

備注：我們所說的膠濃度，實(shí)際是指丙烯酰胺濃度。

（4）濃縮膠配制：

成分	4ml量	6ml量
超純水	2.7ml	4.1ml
30%丙烯酰胺	660μl	1.0ml
1.5M Tris（PH6.8）	500μl	750μl
10%SDS	40μl	60μl
10%AP	40μl	60μl
TEMED	4μl	6μl

備注：濃縮膠一般使用2—3ml即可，濃度一般使用5%。

（5）聚丙烯酰胺凝膠配制：

a.檢漏，選取清洗干凈的模具玻璃，固定于膠固定器上，加入超純水，檢查模具是否漏液；

b.配制分離膠，按所需濃度配制分離膠，配制過程中最后加入TEMED，混勻后灌入模具，防止產(chǎn)生氣泡，并注意高度，最后輕輕加入超純水封口，使液面平整，凝固速度受室溫影響，溫度越高，凝固越快，冬天可放入孵箱中加速凝固；

c.待水和膠之間出現(xiàn)一道折線時(shí)，說明膠已凝固，此時(shí)，將水倒出，并用吸水紙吸干殘余水分；

d.濃縮膠配制，按需量配制濃縮膠，同樣最后加入TEMED，灌入分離膠上面，灌滿模具，排氣泡后插入所需梳子，待膠凝固。

膠一般提前一天配制，配制完成后，可泡到電泳液中，存放于4℃冰箱保存，第二天使用。

手灌膠技術(shù)是WB的基礎(chǔ)入門級(jí)技術(shù)，相對(duì)于昂貴的預(yù)制膠，手灌膠性價(jià)比更高，對(duì)某些蛋白分離效果更好。

系統(tǒng)的掌握WB技術(shù)，依賴于預(yù)制膠遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，預(yù)制膠雖然節(jié)省了配膠的時(shí)間，但還是有特殊蛋白需要手灌膠進(jìn)行分離。

采用快速凝膠 8% 下層分離膠預(yù)混液簡(jiǎn)易之處: 

擠壓瓶中加入相應(yīng)比例TEMED和APS后(等同傳統(tǒng)計(jì)算方式),即可進(jìn)行灌膠,取分離膠擠壓瓶在玻璃板中空縫隙中選擇

一位點(diǎn)擠壓灌入制作分離膠,然后將整座制膠架取起,輕輕拍敲桌面兩下即可